激光熒光共聚焦顯微鏡的應(yīng)用

激光熒光共聚焦顯微鏡是在熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置，可以利用可見光對熒光探針進行激發(fā)，再利用計算機圖像處理技術(shù)獲得細(xì)胞的圖像。激光熒光共聚焦顯微鏡不僅可以觀察固定的細(xì)胞、組織切片，還可以對活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、分子、離子進行實時動態(tài)觀察和檢測。

一.Z-STACK 三維構(gòu)建

激光熒光共聚焦顯微鏡采用的是類似于連續(xù)斷層掃描的方法，即通過移動Z軸獲得一張張連續(xù)的光學(xué)切片，通過計算機可以將這些光學(xué)切片重新組構(gòu)建成一張三維圖像（可做單色或多色圖像處理組合成細(xì)胞真實的三維結(jié)構(gòu)）。通過旋轉(zhuǎn)，可觀察細(xì)胞各個側(cè)面的表面形態(tài)，也可以從斷面觀察細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，測量細(xì)胞的長寬高，體積，細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計等功能。通過shadow功能，可以去除細(xì)胞上的陰影，突出細(xì)胞的立體效果。LSCM的Z-STACK廣泛應(yīng)用于細(xì)胞骨架，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞器等的細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析中。

二. 細(xì)胞靜態(tài)結(jié)構(gòu)檢測，原位鑒定細(xì)胞或組織內(nèi)生物大分子觀察

1.檢測細(xì)胞凋亡

2.細(xì)胞原位檢測核酸

細(xì)胞核定位及其形態(tài)學(xué)觀察，檢測細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制及斷裂情況以及染色體定位觀察

3.細(xì)胞器觀察及測定

4.觀察細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)

5.檢測細(xì)胞內(nèi)脂肪

6.檢測細(xì)胞融合

三.動態(tài)觀察

1.實時定量測定細(xì)胞內(nèi)鈣的變化

2.測定細(xì)胞內(nèi)PH的變化

激光共聚焦顯微鏡是測量若干種離子濃度并顯示其分布的有效工具，對焦點信息的有效辨別使在亞細(xì)胞水平顯示離子分布成為可能。利用熒光探針，可測量單個細(xì)胞內(nèi)PH和多種離子（Ca+，K+，Na+，Mg2+）在活細(xì)胞內(nèi)的濃度及變化。一般來說，電生理記錄裝置加攝像技術(shù)可以快速檢測細(xì)胞內(nèi)離子量變化，激光共聚焦技術(shù)可以提供更好的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中Ca+濃度的動態(tài)變化圖像，對研究Ca+細(xì)胞內(nèi)動力學(xué)有意義。

3.檢測膜電位的變化

JC-1 低電位下單體存在，發(fā)綠色的熒光，高電位下J-聚集體發(fā)紅色的熒光，隨電位增加，紅色熒光也增加。

4.檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧物種的產(chǎn)生

5.藥物篩選

對藥物，病毒，細(xì)菌等進行熒光標(biāo)記，當(dāng)檢測藥物跨膜進入組織或細(xì)胞中時，可檢測藥物是否進入，位置含量以及動態(tài)過程。

6.細(xì)胞間的通訊研究

激光共聚焦顯微鏡可通過觀察細(xì)胞縫隙連接分子的轉(zhuǎn)移來測量傳遞細(xì)胞調(diào)控信息的一些離子，小分子物質(zhì)。該技術(shù)可以用于研究胚胎發(fā)育，生殖發(fā)育，神經(jīng)生物學(xué)，腫瘤發(fā)生等過程中縫隙連接通訊的基本機制和作用，也可以用于鑒別對縫隙連接作用有潛在毒性的化學(xué)物質(zhì)。

7.觀察細(xì)胞遷移和生長

LSCM已經(jīng)極大地提高了光子產(chǎn)生效率，樣品可以與更小毒性的染料結(jié)合減少每次掃描時激光束對細(xì)胞的損傷，可用于數(shù)小時的長時程定時掃描，記錄細(xì)胞遷移和生長等細(xì)胞生物學(xué)現(xiàn)象。

8.檢測熒光漂白的恢復(fù)

當(dāng)一個細(xì)胞內(nèi)的熒光分子被激光漂白或淬滅失去發(fā)光能力，臨近細(xì)胞中未被淬滅的熒光分子可以通過細(xì)胞間的縫隙擴散到已經(jīng)被漂白的細(xì)胞中，從而恢復(fù)熒光。該技術(shù)可用于分析分析細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運輸，受體在細(xì)胞膜上的流動和大分子組裝等細(xì)胞生物學(xué)過程。