激光熒光共聚焦顯微鏡的工作原理

背景

激光熒光共聚焦顯微鏡（CLSM）是近代先進(jìn)的細(xì)胞生物分析/儀器之一。是在1957年，Marvin Minsky首先提出這一概念，經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展才實(shí)現(xiàn)顯微鏡所需要的激光束掃描技術(shù)，點(diǎn)對(duì)點(diǎn)掃描構(gòu)建二維圖像以及到后期根據(jù)多張二維光學(xué)圖像構(gòu)建三維圖像。激光共聚焦顯微鏡是在熒光成像的基礎(chǔ)上加裝激光，激光掃描器，針孔等裝置，使用可見光激光熒光探針結(jié)合計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理，不僅可以觀察固定的細(xì)胞，組織切片還可以對(duì)活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，分子，離子進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)地觀察和檢測(cè)。

工作原理

下圖所示為激光熒光共聚焦顯微鏡的光路圖，輸出激光通過(guò)照明針孔再經(jīng)由分色鏡反射到物鏡，最后聚焦到樣品表面，激光會(huì)與生物組織樣本中的熒光物質(zhì)相互作用產(chǎn)生熒光，部分熒光信號(hào)會(huì)沿著入射光路相反方向通過(guò)物鏡后進(jìn)入二向色鏡（Beam Splitter），最終被探測(cè)器收集。由于針孔與樣品的焦平面處形成共軛關(guān)系，所以焦平面以外的反射信號(hào)會(huì)被針孔濾除，使得共聚焦顯微鏡具有一定的層析能力。經(jīng)過(guò)針孔后的熒光信號(hào)具有較強(qiáng)的層析能力，同時(shí)由于光強(qiáng)較弱，需要使用靈敏度較高的光電探測(cè)器進(jìn)行探測(cè)。光電倍增管可以將熒光信號(hào)放大并轉(zhuǎn)換為電信號(hào)（光電探測(cè)器輸出的電信號(hào)強(qiáng)度與熒光強(qiáng)度成正比）然后傳輸給電腦，電腦通過(guò)特定的處理方法將電信號(hào)轉(zhuǎn)換成圖像信息。

共聚焦顯微鏡的構(gòu)成

激光器（Laser）

配置四條激光通道（405nm，488nm，561nm，638nm，波長(zhǎng)可選）

二向色鏡（Dichromatic）

二向色鏡作為一個(gè)濾光片（Filter）可將熒光中摻雜的激光分離出來(lái)，以便于熒光的后續(xù)處理。

XY掃描鏡組（Scanner）

由一個(gè)或多個(gè)反射鏡組成的鏡組，用于引導(dǎo)聚焦后的激光在樣本上進(jìn)行點(diǎn)對(duì)點(diǎn)（Pixel-by- pixel）和行對(duì)行（Line- to- line）的掃描。

針孔（Pinhole）

用于提高共聚焦顯微鏡的層析能力，可濾除焦點(diǎn)以外的熒光信號(hào)。

應(yīng)用

如下圖所示，使用激光共聚焦顯微鏡對(duì)花粉進(jìn)行3D成像，激發(fā)光源為488納米激光，通過(guò)將一張張光學(xué)切片按順序重構(gòu)可以得到下圖所示的三維圖像。

Time Lapse(延時(shí)功能）