熒光共聚焦顯微鏡的成像原理是怎樣的？

　　熒光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)主要包括掃描模塊、激光光源、熒光顯微鏡、數(shù)字信號(hào)處理器、計(jì)算機(jī)和圖像輸出設(shè)備。那么你知道它的成像原理是怎樣的嗎？

　　

　　熒光共聚焦顯微鏡用一個(gè)點(diǎn)光源來(lái)照射標(biāo)本，在焦平面上形成一個(gè)小的、定義明確的光斑。該光斑照射后發(fā)出的熒光由物鏡收集，并沿原照射光路送回由雙向色鏡組成的分光器。分光器將熒光直接送到檢測(cè)器。在光源和檢測(cè)器前面都有一個(gè)針孔，分別稱為照明針孔和檢測(cè)針孔。兩者的幾何尺寸相同，約為100-200納米；相對(duì)于焦平面上的光點(diǎn)，兩者是共軛的，也就是說(shuō)，光點(diǎn)可以通過(guò)一系列透鏡同時(shí)聚焦于照明針孔和檢測(cè)針孔。這樣，來(lái)自焦平面的光可以集中在檢測(cè)孔的范圍內(nèi)，而來(lái)自焦平面上方或下方的散射光則被阻擋在檢測(cè)孔之外，無(wú)法成像。激光對(duì)樣品進(jìn)行逐點(diǎn)掃描，檢測(cè)針孔后的光電倍增管也逐點(diǎn)獲得相應(yīng)光點(diǎn)的共焦圖像，轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)傳輸給計(jì)算機(jī)，最后在屏幕上匯集成整個(gè)焦平面的清晰共焦圖像。
 

　　

　　每個(gè)焦平面圖像實(shí)際上是標(biāo)本的一個(gè)光學(xué)截面，它總是有一定的厚度，也被稱為光學(xué)切片。由于焦點(diǎn)處的光強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于非焦點(diǎn)處的光強(qiáng)度，而非焦點(diǎn)面的光被針孔過(guò)濾，所以共焦系統(tǒng)的景深近似為零。沿著Z軸方向掃描可以實(shí)現(xiàn)光學(xué)斷層掃描，在待觀察樣品的焦點(diǎn)處形成一個(gè)二維的光學(xué)切片。將X-Y平面（焦平面）掃描與Z軸（光軸）掃描相結(jié)合，通過(guò)積累連續(xù)層的二維圖像，用專門的計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行處理，就可以得到樣品的三維圖像。即檢測(cè)針孔和光源針孔始終聚焦在同一點(diǎn)上，使聚焦面以外的激發(fā)熒光不能進(jìn)入檢測(cè)針孔。

　　

　　熒光共聚焦顯微鏡的工作原理可以簡(jiǎn)單表述為：以激光為光源，在傳統(tǒng)熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上增加激光掃描裝置和共軛聚焦裝置，通過(guò)計(jì)算機(jī)控制進(jìn)行數(shù)字圖像采集和處理的系統(tǒng)。