激光共聚焦顯微鏡的工作原理如下：

　　

　　1、激光光源：

　　

　　使用一束強度穩定、單色、相干性好的激光光源，常用的激光光源包括氬離子激光器、氦氖激光器和二極管激光器等。激光光源通過準直器和聚焦鏡系統聚焦成一束準直的、直徑極小的激光光斑。

　　

　　2、共聚焦技術：

　　

　　采用共聚焦技術，即通過聚焦光斑和探測光斑的重疊來實現高分辨率成像。聚焦光斑從樣品的一個點與探測光斑重疊之后，僅有從這個點散射回來的光能夠通過探測光斑，其他來自樣品其他區域的光則被阻隔掉。這樣可以消除樣品其他區域的散射光對圖像質量的影響。

　　

　　3、掃描成像：

　　

　　激光束經照明針孔形成點光源對標本內焦平面的每一點進行掃描。組織樣品中如果有可被激發的熒光物質，受到激發后發出的熒光經原來入射光路直接反向回到分光鏡，通過探測針孔時先聚焦，聚焦后的光被光電倍增管（PMT）或冷電耦器件（cCCD）逐點或逐線接收，迅速在計算機監視器屏幕上形成熒光圖像。在這個光路中，只有在焦平面的光才能穿過探測針孔，焦平面以外區域射來的光線在探測小孔平面是離焦的，不能通過小孔，因此非觀察點的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。由于照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點同時聚焦于照明針孔與探測針孔，焦平面以外的點不會在探測針孔處成像，即共聚焦。以激光作光源并對樣品進行掃描，在此過程中兩次聚焦，故稱為激光掃描共聚焦顯微鏡。

　　

　　4、三維成像：

　　

　　通過自動移動焦點位置獲取多個共焦圖像，根據非連續的焦點位置（Z）和檢測光強度（I），系統可以估算每個像素的光強變化曲線（I-Z曲線），并獲得其峰值位置和峰值強度。由于所有像素的峰值位置與樣品表面的不規則性相對應，因此可以獲得樣品表面的3D形貌信息。

　　

　　總之，激光共聚焦顯微鏡利用激光光源、共聚焦技術以及掃描成像等原理，實現了對樣品的高分辨率、高對比度、非破壞性的三維成像和表面拓撲分析，在生物醫學等領域具有廣泛的應用價值。