隨著先進(jìn)和微創(chuàng)外科技術(shù)的發(fā)展，手術(shù)中對(duì)病變組織的實(shí)時(shí)快速診斷成了一項(xiàng)困擾科研人員的難題。激光共聚焦顯微鏡（簡(jiǎn)稱LSCM），因其高分辨率和深度層析成像的優(yōu)勢(shì)而受到關(guān)注，具有對(duì)活細(xì)胞和生物組織樣品進(jìn)行無(wú)損實(shí)時(shí)觀察的特點(diǎn)

本文旨在開(kāi)發(fā)一種使用激光共聚焦顯微鏡對(duì)病變組織進(jìn)行快速診斷的方法。

K1-Fluo ABM 激光共聚焦顯微鏡的成像原理

K1-Fluo ABM是一款采用多通道激光熒光技術(shù)的共聚焦顯微鏡，與普通的熒光顯微鏡相比，有著更高的空間分辨率，*的三維成像方面有著明顯的優(yōu)勢(shì)。在細(xì)胞和組織切片的形態(tài)定位，立體結(jié)構(gòu)重組，觀察生化功能動(dòng)態(tài)變化過(guò)程方面有著*的優(yōu)勢(shì)。

K1－Fluo ABM配有(405nm. 488nm，561nm，638nm)四種不同波長(zhǎng)的激光，在激光光源后面和檢測(cè)器的前面分別設(shè)置一個(gè)“針孔"兩者形成共軛關(guān)系，激光通過(guò)“照明針孔"后聚焦在樣品焦平面的某個(gè)點(diǎn)上，該點(diǎn)被激發(fā)出來(lái)的熒光信號(hào)通過(guò)“探測(cè)針孔"后被電荷耦合元件（CCD）或光電倍增管（PMT）逐線或逐點(diǎn)接收轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，再通過(guò)計(jì)算機(jī)對(duì)電信號(hào)進(jìn)行處理最后轉(zhuǎn)換成圖像信號(hào)輸出。只有焦點(diǎn)處的光能沿著光路到達(dá)探測(cè)器，因此有效地降低了噪音，大大提高了圖像的質(zhì)量。

通過(guò)沿垂直方向移動(dòng)Z軸，可以獲得一張張光學(xué)切片，再通過(guò)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)圖像進(jìn)行處理就可以獲得樣品的三維立體圖像。

K1－Fluo 的配置

K1-Fluo ABM 鏡身,　激光器、掃描器、控制器、PC和顯示器一整套系統(tǒng)。

K1-Fluo 的底部配置有一塊磁懸浮隔振板（Magnetic floating anti-vibration plate）可以有效的隔絕一些自然振動(dòng)，從而保證鏡身不受到外部震動(dòng)的干擾，獲得高質(zhì)量的圖像。與傳統(tǒng)笨重的空氣光學(xué)平臺(tái)不同，磁懸浮隔振板非常地輕便，放在普通的實(shí)驗(yàn)桌上就可以使用。而且K1-Fluo還可以根據(jù)使用者的需要增加DIC（微分干涉）和適用于LED激發(fā)熒光的濾波片，細(xì)胞孵化器等多種配件，兼容性非常強(qiáng)。

K1-Fluo ABM 在組織診斷中的應(yīng)用

一般情況下制備組織切片樣品需要以下的步驟：

(1)    Gross examination

(2)    Fixation

(3)    Washing

(4)    Dehydration

(5)    Cleaning

(6)    Impregnation or Infiltration

(7)    Embedding－Trimming

(8)    Microtome cutting

(9)    Stain

(10) Mounting.

由于該過(guò)程很長(zhǎng)，因此不能用于手術(shù)期間的組織實(shí)時(shí)診斷。2019年由韓國(guó)高陽(yáng)市國(guó)家癌癥中心，漢陽(yáng)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系，韓國(guó)大田Nanoscope Systems,Inc ，韓國(guó)忠清北道Osong醫(yī)療創(chuàng)新基金會(huì)等聯(lián)合研究開(kāi)發(fā)一種使用共聚焦顯微鏡檢查的簡(jiǎn)單組織染色后不需要冷凍和切片的組織診斷方法。 該方法可作為適合在手術(shù)室使用的快速診斷一部分組織的方法。當(dāng)需要快速診斷組織時(shí)，可以使用最佳切割溫度（OCT）化合物在將組織切成薄片之前快速冷凍（Bancroft＆Gamble，2008年）。在癌癥手術(shù)中，獲得前哨淋巴結(jié)活檢結(jié)果對(duì)于確定所需的手術(shù)范圍至關(guān)重要。在諸如Mohs手術(shù)的皮膚癌手術(shù)中，為了正確考慮外觀和功能方面，在手術(shù)過(guò)程中需要進(jìn)行幾次冷凍切片活檢。這種類型的冷凍切片組織診斷需要大約15-40分鐘。但是，由于其影響，人們已集中精力減少這種時(shí)間。

最近引入了使用共聚焦顯微鏡進(jìn)行術(shù)中診斷的方法，使用快速的 Hoechst 組織染色方法，我們?cè)诖蠹s 2 分鐘的組織采集后可成功獲得組織圖像。我們發(fā)現(xiàn)，從動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)獲得的圖像可用于快速組織診斷，而無(wú)需組織切片。

(1)H&E 染色后光學(xué)顯微鏡下結(jié)腸正常黏膜的組織學(xué)圖像 (2) 在 Hoechst 33342 & Eosin 染色后，來(lái)自 K1-Fluo_RT 共聚焦顯微鏡的相同結(jié)腸正常粘膜的偽彩色圖像 (3) H&E染色后光學(xué)顯微鏡下胃癌組織學(xué)圖像 (4) Hoechst術(shù)后K1-Fluo_RT共聚焦顯微鏡下同一胃腫瘤的偽彩色圖像。 33342 & 曙紅染色 (5) H&E染色后光學(xué)顯微鏡下的乳腺癌組織學(xué)圖像 (6) Hoechst 33342 & Eosin 染色后 K1-Fluo_RT 共聚焦顯微鏡下同一乳腺癌的偽彩色圖像

在這項(xiàng)研究中，我們研究了選擇曙紅Y染料（Ex 488 nm / Em 499–633 nm）對(duì)蛋白質(zhì)染色，選擇Hoechst 33342（Ex 405 nm / Em 410–1313 nm）染色，該熒光染料具有不同的熒光波長(zhǎng)選擇比曙紅Y染色的細(xì)胞核染色。使用便攜式共焦顯微鏡（K1-Fluo_RT，Nanoscope Systems，韓國(guó)）使用相應(yīng)的熒光信號(hào)捕獲共焦圖像。

K1-Fluo具有以下優(yōu)勢(shì)，首先通過(guò)采用各種熒光材料進(jìn)行染色，它可以用來(lái)同時(shí)識(shí)別組織中的各種結(jié)構(gòu)。 其次，使用熒光染料試劑綁定到抗體或類似化合物中，可以確認(rèn)組織中各種遺傳或蛋白質(zhì)的表達(dá)特征。第三，通過(guò)K1-Fluo熒光共聚焦顯微鏡可以獲得數(shù)字熒光圖像，從而進(jìn)行各種精確的數(shù)據(jù)處理和分析。最后，利用K1-Fluo的Z-STACK功能 可以獲取需要的薄組織的三維立體圖像，從而可以分析細(xì)胞組織的各種三維立體數(shù)據(jù)。

結(jié)論

雖然，熒光共聚焦顯微鏡在手術(shù)期間的實(shí)時(shí)診斷還未普及， 但是我們相信在不遠(yuǎn)未來(lái)K1-Fluo 有望成為微創(chuàng)外科手術(shù)行業(yè)有效的實(shí)時(shí)檢測(cè)設(shè)備

目前，韓國(guó)各生命工程學(xué)院，醫(yī)藥研究所已經(jīng)成為K1-Fluo 的忠實(shí)客戶。